产品及特点
蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus，tbev)是一种rna病毒，由蜱传播，在春夏季节流行于俄罗斯及我国东北森林地带，非疫区易感人被带有病毒的蜱叮咬后，易感染发病，另外因喝生羊奶（羊感染时奶中有病毒或被蜱类污染）而被传染，约经8～14天潜伏期后发生脑炎，出现肌肉麻痹、萎缩、昏迷致死，少数痊愈者也常遗留肌肉麻痹。居住在森林疫区的发生脑炎，出现肌肉麻痹、萎缩、昏迷致死，少数痊愈者也常遗留肌肉麻痹，因此快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本产品基于pcr原理开发。它具有下列特点：
一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。根据蜱传脑炎病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。基于染料法qrt-pcr检测，灵敏度比常规rt-pcr高10-100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。使用一管式qrt-pcr技术，rt和pcr两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。本产品足够50次30μl体系的rt-pcr，只能用于科研，不能用于临床。
规格及成分
成 份
编号
十孔盒包装
2×qrt-pcr 缓冲液
190101a
500 μl（棕色管）
10×qrt-pcr酶混合液
190101b
100 μl（红盖）
rox染料i
190101c
50 μl（棕色管）
rox染料ii
190101d
50 μl（棕色管）
荧光pcr专用模板稀释液
180701
1ml（亮黄盖）
蜱传脑炎病毒rt-pcr引物混合液
14-19500yw
100 μl（白盖）
蜱传脑炎病毒rt-pcr阳性对照
（1×10e8拷贝/μl）
14-19500pc
50 μl（黄盖）
天净沙核酸释放剂试用装
61202
20次（1ml，绿盖）
使用手册
14-19500sc
1份
运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供rna段作为阳性对照。
自备试剂
样品rna
使用方法
一、稀释阳性对照（以10e2-10e7这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。
标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入45 μl 荧光pcr专用模板稀释液，用带芯枪头，下同）。在7号管中加入5 μl 1×10e8拷贝/μl 的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10e7拷贝/μl的阳性对照。放冰上待用。换枪头，在6号管中加入5 μl 1×10e7拷贝/μl 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10e6拷贝/μl的阳性对照。放冰上待用。换枪头，在5号管中加入5 μl 1×10e6拷贝/μl 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10e5拷贝/μl的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。二、样品rna的制备
如果有n个样品，必须设置n+2个提取，多出的一个是pc（样品制备阳性对照），一个是nc（样品制备阴性对照）。可以用10μl上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号（浓度为1×10e4拷贝/μl，10μl相当于1万拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。用自选方法纯化n+2个样品的rna，本试剂盒跟市场上大多数病毒rna提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送20次免rna提取的天净沙核酸释放剂试用装，三、设置rt-pcr反应（20μl体系，在样品制备室进行）
如果做定量分析并且只做1次重复，则标记n+9个pcr管，其中n+2个用于上步得到的n+2个样品，1个用于pcr阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记n+4个pcr管，其中n+2个用于上步得到的n+2个样品，1个用于pcr阴性对照（用水做模板），1个用于pcr阳性对照（用第4号阳性对照稀释液做模板）。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个，其余不变。在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后后加）：成分
n+2个制备所得样品
rt-pcr阴性对照
rt-pcr阳性
对照（2-7管）
2×qrt-pcr 缓冲液
10μl
10μl
各10μl
口蹄疫病毒rt-pcr
引物混合物
2μl
2μl
各2μl
50×rox (见注)
0.4μl
0.4μl
各0.4μl
样品制备所得rna模板（来于第8步）
5.6μl
不加
不加
稀释所得6个阳性对照（来于第6步）
不加
不加
各5.6μl（2号样到2号管，3号样到3号管…）
10×qrt-pcr
酶混合液
2μl
2μl
2μl
注:需使用rox染料i的机型：abi prism7000、7300、7700、7900ht、step-one、step-one plus。
需使用rox染料ii的机型：：abi prism 7500、7500fast、mj research的chromo4、opticon（ii）corbett rotor gene 3000。
不需要使用rox的机型：thermal cycle dice real time system， lightcycler、smart cycler system、agilent mx3000p、rotorgene 3000、rotorgene 6000。
上机后按下面参数进行rt-pcr（参数可能会因仪器不同而需优化）。过程
温度
时间
rt（逆转录）
50℃
15-30分钟
预变性
94℃
2分钟
rt - pcr反应
（30个循环）
95℃
15 秒
60℃
15 秒（采集fam通道的荧光信号）
72℃
15 秒
按仪器预设程序进行溶解曲线分析
数据处理如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的ct值从标准曲线上推算出样品rna浓度的log值，再推算出其浓度。如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。
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上海雅吉生物科技有限公司
